畜牧兽医学报

作者：郑晓茹, 王一丹, 张丽红, 杨莹莹, 赵欣如, 李敏, 黄娟, 张乔亚, 曹志

单位：青岛农业大学动物医学院, 青岛 266109

关键词：猪瘟病毒,NS3-NS4A,NS3pro-NS4A,猪肺泡巨噬细胞,稳定表达

基金：国家自然科学基金青年科学项目(32002269)；山东省生猪产业技术体系疫病控制岗位(SDAIT-08-07)

本研究旨在通过构建稳定表达的猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)NS3-NS4A和NS3pro-NS4A蛋白巨噬细胞系，以期更好地探索宿主天然免疫与CSFV的相互作用关系。利用琼脂糖凝胶电泳、连接与转化和提取质粒等方法对重组表达载体进行构建，将构建好的pCMV-CBH-GFP-2A-Puro-CSFV NS3pro-NS4A、pCMV-CBH-GFP-2A-Puro-CSFV NS3-NS4A和pCMV-CBH-GFP-2A-Puro重组表达载体分别感染HEK-293T细胞包装出慢病毒。然后利用包装成功的慢病毒感染猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)，对感染细胞进行单克隆筛选得到稳定转染细胞系，最后用Western blot方法验证稳定细胞系蛋白表达。对其进行蛋白组学分析，筛选出MAPK、PI3K通路的相互作用蛋白，并进行功能分析，利用Western blot检测CDK4、CDC37、CASP3、IKBKG、NFκB1蛋白表达量。结果表明，经MegAlign分析构建的过表达CSFV非结构蛋白NS3-NS4A以及NS3pro-NS4A慢病毒载体氨基酸序列全部正确，无移码；重组表达载体感染293T细胞24 h后，感染效率可达90%以上，慢病毒包装成功；Western blot分析成功获得稳定表达CSFV NS3-NS4A、NS3pro-NS4A巨噬细胞系；通过蛋白组学分析，筛选出NS3-NS4A/mock组中MAPK与PI3K通路中上调蛋白11个，下调蛋白24个；经Western blot检测CSFV NS3-NS4A显著降低了MAPK通路中CASP3、NFκB1、IKBKG的表达，PI3K通路中CDK4、CDC37的表达。本研究成功构建了稳定表达NS3-NS4A、NS3pro-NS4A蛋白的3D4/21细胞系，并对蛋白组学筛选的关键蛋白进行功能分析，为研究CSFV NS3-NS4A调控宿主天然免疫应答的机制提供物质基础。

来源：2025年第11期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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