畜牧兽医学报

作者：周心仪, 杨利丹, 高晨, 魏新华, 霍浩楠, 邹惠影, 余大为, 杜卫华

单位：1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2. 河北农业大学生命科学学院，保定 071031

关键词：野猪,诱导多能干细胞,电转染,脂质体,X染色体定点整合

基金：国家重点研发计划(2024YFD1301002)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2023-YWF-ZYSQ-04)；中国农业科学院科技创新工程项目(ASTIP-IAS06)

本研究旨在建立具有稳定传代能力的野猪诱导多能干细胞系(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，并将外源基因定点整合于iPSCs的X染色体，为野猪的资源保存和开发利用提供技术支撑。利用PiggyBac转座子系统将8种多能性因子导入野猪成纤维细胞，诱导建立iPSCs系，并鉴定其多能性；分别采用电转染(3种程序)、化学转染试剂lipofectamine 3000(Lip 3000)和jetPRIME将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的质粒转入野猪iPSCs，通过流式细胞仪分析转染效率筛选最优转染方案；结合CRISPR/Cas9和不依赖于同源重组的定点整合技术，将筛选获得的高效sgRNA与GFP表达元件共转染野猪iPSCs，PCR扩增目的片段，并测序鉴定GFP的定点整合。本研究将人源OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、NANOG、LIN28、NR5A2和miR302/367导入野猪成纤维细胞，诱导后20 d获得野猪iPSCs，其核型正常，碱性磷酸酶染色阳性，能稳定表达多能性因子OCT4、SOX2和NANOG，可体外形成拟胚体，并标记到三胚层的标志蛋白(β Ⅲ-微管蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和GATA6)。对于不同的电转染程序，CG104程序的细胞转染效率为(9.73±0.23)%，显著高于CA201((7.34±0.03)%)和CB150程序组((6.69±0.10)%)；而使用jetPRIME阳离子聚合物的细胞转染效率为(17.9±0.36)%，极显著高于Lip 3000((14.07±0.85)%)。成功构建分别携带sgRNA与GFP表达元件的两个质粒，共转染野猪iPSCs后，PCR和测序结果显示，GFP表达元件定点插入至X染色体的预定位置，且能够稳定表达。本研究将野猪成纤维细胞诱导为可稳定传代的iPSCs，并通过不依赖同源重组的定点整合技术将GFP敲入iPSCs的X染色体，为野猪的基因编辑和家猪育种提供技术借鉴。

来源：2025年第10期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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