畜牧兽医学报

作者：张雲龙, 王靖雷, 朱亚杰, 张明洁, 康澳, 周翔, 魏凯, 曹洪防, 李强, 王勇, 苏峰

单位：1. 山东省人畜共患病重点实验室 山东农业大学动物医学院, 泰安 271018；2. 济南市农业农村局 山东省羊产业技术体系济南综合试验站, 济南 250099

关键词：布鲁氏菌,RAA,DETECTOR系统,SHERLOCK系统,AsCas12a,LwaLwaCas13a

基金：国家重点研发计划(2023YFF1000900);山东省现代农业产业技术体系建设经费(SDAIT-10-05;SDAIT-10-015)

本研究旨在建立不依赖于专业设备的布鲁氏菌病高效快速检测体系, 实现临床样本40 min内快速检测。首先比对不同布鲁氏菌的基因组, 找到布鲁氏菌的核心共有序列, 以布鲁氏菌S2菌株基因SEQ NO.6(CN 105018489A)为模板构建阳性质粒, 用于后续试验; 通过原核表达的方法分别表达CRISPR/AsCas12a和LwaCas13a蛋白; 通过重组酶介导的等温核酸扩增技术(RAA)、体外表达技术结合AsCas12a/LwaCas13a的DETECTOR系统, 优化高效检测体系、通过无限稀释法等进行检测。结果发现, 设计的RAA引物能够有效扩增样本中的DNA片段, DETECTOR得到最佳反应的AsCas12a浓度为200 nmol·L-1, gRNA为200 nmol·L-1; Cas13a浓度为300 nmol·L-1, crRNA浓度为400 nmol·L-1; RAA-AsCas12a和RAA-LwaCas13a的检测体系的最佳反应时间为35 min, 侧平流式纸条的最佳检测时间为20 min, 细菌最低检测浓度为10 Copies·μL-1, 且具有较好的检测特异性, 临床样本的检测试验表明两种方法均有较好的重复性和检测精度, 但LwaCas13a的精测精度更高, 但二者无显著差异。该研究建立了2种RAA-CRISPR/Cas布鲁氏菌核酸快速检测体系, 在临床上可获得较好的应用, RAA-LwaCas13a的检测方法精度更高。

来源：2025年第10期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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