畜牧兽医学报

作者：邱话龙传, 金芊芊, 许潇涵, 周静, 蔡承志, 李龙

单位：1. 浙江农林大学动物医学院, 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室, 动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心, 浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地, 同一健康和食品安全"一带一路"国际联合实验室, 中澳动物健康大数据分析联合实验室, 杭州 311300；2. 浙江家禾泰弘生物科技有限公司, 杭州 311112

关键词：纳米孔靶向测序,PCR,一致性,猪病原

旨在研究一套用于纳米孔靶向测序(nanopore targeting sequencing, NTS)的同时检测10种猪病原的引物组，并以此探索后续在此平台上检测全部猪病原的可能性。用Primer Premier 6软件设计10种病原的引物；用PCR及琼脂糖凝胶电泳方法验证10种引物的特异性；用纳米孔测序技术探索多重PCR体系中的最优引物浓度，通过比对各浓度梯度下的病原检出数量确定最优引物浓度；用纳米孔测序技术验证多重PCR的敏感性，用最优引物浓度对不同浓度梯度的病原模板进行扩增，确定检测敏感性；最后用临床样本(n=201)用荧光定量PCR对NTS进行符合性测试。结果显示：10种猪病病原引物特异，对其他10种猪病原均未扩出条带；反应体系中的引物终浓度在3和5 μmol·L-1时，能检测到模板中的10种病原；在加入5 μL浓度为9×102 copies·mL-1的核酸模板时，可检出4组重复中的所有阳性样本；在临床样本的检测上，NTS检测出的病原阳性数量更多。经卡方检验，两者对5种病原的检测结果存在统计学差异(P < 0.05)，另5种不存在统计学差异(P>0.05)；经卡帕值分析，6种病原检测的一致性极好，4种较好。结果显示，NTS检测方法可以同时检测出10种不同的猪病原，对于两种检测方法结果不符合样本需经第三方检测方法进一步验证。

来源：2025年第9期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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