畜牧兽医学报

作者：高林娜, 蒋影影, 王悦, 史倩倩, 安振江, 王慧利, 沈阳阳, 陈坤琳, 张乐颖

单位：1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院, 邯郸 056038；2. 江苏省农业科学院畜牧研究所, 江苏省畜禽精准育种工程研究中心, 农业农村部种养结合重点实验室, 南京 210014；3. 南京农业大学动物科技学院, 南京 210095

关键词：牛,CRISPR/Cas9,全基因组,敲除质粒文库,牛乳腺上皮细胞,敲除细胞文库

基金：国家自然科学基金(32472872);江苏省重点研发项目(BE2021372)

旨在构建奶牛乳腺CRISPR/Cas9全基因组敲除细胞文库，用于筛选与奶牛泌乳、应激及疾病等相关的功能基因。本研究靶向牛全基因组蛋白编码基因，利用CRISPR/Cas9技术设计合成转录sgRNAs文库，克隆至慢病毒载体LentiCRISPR-V2，建立牛全基因组CRISPR/Cas9敲除质粒文库，并进行gEditing ScreeningTM文库测序验证；然后将敲除质粒文库进行慢病毒包装和滴度测定，感染牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells，bMECs)后经嘌呤霉素抗性筛选及RT-qPCR、Western blot技术确定最佳感染效果，最终通过高通量测序验证敲除细胞库中sgRNA覆盖率确定细胞文库质量。本研究构建的全基因组敲除质粒文库共靶向20 545个蛋白编码基因，包含61 237条sgRNA和3 062条牛基因组上无靶点的sgRNA；gEditing ScreeningTM质粒文库测序结果显示，全基因组质粒文库覆盖率为100%，均一性为2.35，测序深度为577×；进一步对质粒文库进行慢病毒包装，获得滴度为7.01×108 TU·mL-1的病毒液并感染bMECs, 嘌呤霉素筛选14 d得到MOI=0.2、0.3、0.4、0.5的稳转细胞株，RT-qPCR、Western blot结果表明，MOI=0.2时感染效果最佳；高通量测序结果显示，细胞文库覆盖率为78.74%，碱基稳定、序列质量较高。综上所述，牛全基因组质粒文库、全基因组敲除细胞文库符合质量标准和试验需求，能为挖掘调控牛泌乳性状及乳腺健康的关键基因研究提供重要的细胞筛选平台。

来源：2025年第6期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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