畜牧兽医学报

作者：刘芯孜, 赵海渊, 鞠宁, 陈莹, 王梓, 孟伟静, 李佳璇, 姜艳平, 崔文, 王晓娜

单位：1. 东北农业大学动物医学学院, 哈尔滨 150030；2. 动物疾病防控技术与制剂创制省重点实验室, 哈尔滨 150030；3. 逊克县农业农村局, 逊克 161499；4. 通辽市农牧科学研究所, 通辽 028000；5. 通辽市农牧业发展中心, 通辽 028000

关键词：乳酸菌表达系统,组成型启动子Pldh,启动子活性,外源基因表达效率

基金：黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2021C043)；国家自然科学基金青年(32102707)

旨在利用AmpR(氨苄青霉素抗性)报告基因表达系统，构建不同数量乳酸菌组成型启动子Pldh串联、启动子Pldh与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统，分别检测AmpR报告基因转录水平、蛋白表达量并评价AMPR酶活性，从而筛选出稳定且强表达的组成型多启动子表达系统，为乳酸菌活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。对Pldh启动子进行生物信息学分析，构建不同数量启动子Pldh串联的重组乳酸菌以及启动子与外源基因AmpR不同顺序重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR、Western blot、间接ELISA检测以及氨苄青霉素活菌筛选试验综合评估不同表达系统中外源基因表达的强弱。PCR结果显示重组乳酸菌成功扩增出600、900、2 300和2 300 bp的Pldh-Pldh、Pldh-Pldh-Pldh、Pldh-AmpR-Pldh-AmpR和Pldh-Pldh-AmpR-AmpR目的片段；Western blot结果显示重组菌均可表达AMPR蛋白，目的蛋白大小均约为28 ku。间接ELISA、荧光定量PCR和AMPR酶活性检测结果均显示，在不同数量启动子Pldh串联乳酸菌表达载体系统中，三启动子驱动AmpR报告基因表达的效率显著高于双启动子(P < 0.05)，三启动子、双启动子驱动AmpR报告基因表达的效率均极显著高于单启动子(P < 0.01)，且均极显著高于对照菌pPG-Ampr/HLJ-27(P < 0.01)；在启动子Pldh与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统中，重组菌pPG-Pldh-Pldh-Ampr-Ampr/HLJ-27驱动AmpR报告基因表达的效率极显著高于重组菌pPG-Pldh-Ampr-Pldh-Ampr/HLJ-27(P < 0.01)。本研究利用AmpR报告基因成功构建了5种组成型多启动子Pldh乳酸菌表达系统，结果显示在不同数量启动子Pldh串联驱动单外源蛋白载体系统中，启动子调控转录进而驱动外源基因表达量与启动子数量呈正相关；在双启动子驱动双外源蛋白载体系统中，连续串联两个启动子调控转录进而驱动双外源基因表达效率显著高于两个启动子分别驱动双外源基因表达效率；以上数据为乳酸菌表达载体对外源蛋白的表达效率优化提供了必要的依据。

来源：2025年第6期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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