畜牧兽医学报

作者：倪君丽, 刘欣超, 孙栋, 方肆云, 王定爱, 申翰钦, 严专强, 戚南山, 孙铭飞, 顾有方

单位：1. 安徽科技学院动物科技学院，凤阳 233100；2. 广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室，广州 510640；3. 温氏食品集团股份有限公司，新兴 527400

关键词：柔嫩艾美耳球虫,多表位重组质粒,真核表达,DNA疫苗

基金：“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目(2023SDZG02);广东省基础与应用基础研究基金项目(2021B1515120006);广东省科技计划项目(2021B1212050021);广东省科技计划项目(2023B1212060040);猪禽种业全国重点实验室开放课题(2023QZ-NK05);猪禽种业全国重点实验室开放课题(2022GZ07);广州市科技计划项目(2023B04J0137);广州市科技计划项目(2023A04J0789);云浮市科技计划项目(20220202

为构建以鸡柔嫩艾美耳球虫EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相关蛋白分子为抗原基础的多表位嵌合重组抗原ET seven真核表达质粒，同时验证其在DF-1细胞中的表达和通过不同辅助递送方式在鸡体内的表达及其免疫功能。本研究利用生信分析获得7个抗原表位，分别提取柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体总RNA，通过RT-PCR扩增获得EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等7个抗原的表位区域编码基因，构建基因图谱由公司合成以pcDNA3.1(+)为真核表达载体，构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven；将鉴定阳性、测序正确的质粒pcDNA3.1-ET seven转染至DF-1细胞，利用RT-PCR和Western blot方法检测ET seven重组基因片段在DF-1细胞中的表达；以磷酸钙纳米颗粒作为辅助质粒递送佐剂检测pcDNA3.1-ET seven在鸡体内引起的细胞因子水平变化，间接ELISA检测特异性IgG抗体水平。结果显示：成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven，RT-PCR和Western blot检测到ET seven的特异性表达，质粒通过磷酸钙纳米佐剂免疫鸡体后，检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均在三次免疫后7 d高水平表达，其中CD-40与IL-6的表达水平最高。pcDNA3.1-ET seven重组质粒结合磷酸钙佐剂肌肉注射二次免疫后7 d间接ELISA检测特异性IgG抗体呈阳性。结果表明，pcDNA3.1-ET seven重组质粒构建成功，在鸡体内有良好的免疫原性，为鸡球虫病的疫苗防控提供新的思路和技术支撑。

来源：2024年第11期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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