畜牧兽医学报

作者：丁修虎, 林志平, 赵芳, 陈坤琳, 仲跻峰, 张燕, 高运东, 李惠侠, 王慧利, 张建丽, 丁强

单位：1. 江苏省农业科学院畜牧研究所, 江苏省畜禽精准育种工程研究中心, 农业农村部种养结合重点实验室, 南京 210014；2. 南京农业大学动物科技学院, 南京 210095；3. 江苏优源奶业产业研究院有限公司, 南京 211100；4. 山东奥克斯畜牧种业有限公司, 济南 250100

关键词：BLG基因,牛乳腺上皮细胞系,CRISPR/Cas9,基因编辑

基金：江苏省重点研发项目“基于新型单碱基编辑器的奶牛高效精准育种技术研究”(BE2021372);江苏省农业科学院探索性颠覆性创新计划项目(ZX(21)1214)

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cells, bMECs)，同时检测BLG基因敲除后对细胞的影响。本研究利用体外切割试验筛选获得靶向牛的BLG基因的第一外显子序列的3条sgRNA，与CRISPR/Cas9表达载体电转染入bMECs，利用浓度为1.8 μg·mL-1嘌呤霉素和6 μg·mL-1稻瘟菌素双药筛和PCR分析鉴定获得BLG基因编辑的单克隆细胞株；利用Western blot(WB)验证细胞BLG表达；绘制生长曲线和CCK-8试验检测BLG基因敲除对bMECs细胞增殖的影响；同时根据sgRNA序列，对基因组上潜在脱靶位点进行PCR测序分析。经筛选和PCR序列分析，共筛选获得了9株BLG基因编辑细胞株，其编辑效率为90%(9/10)，其中4株细胞株BLG基因大片段删除。序列分析结果显示，单克隆细胞株编辑位点呈现片段插入缺失和碱基替换等多种编辑类型，WB结果显示敲除细胞株BLG蛋白表达显著降低，且细胞生长曲线和CCK-8检测结果表明BLG基因敲除的细胞生长速度加快。本研究利用CRISPR/Cas9技术成果构建了牛乳腺上皮细胞BLG基因高效敲除方法，BLG基因敲除后可显著影响牛乳腺上皮细胞的增殖，为探究BLG敲除牛在乳腺上皮细胞水平探究其功能机制提供细胞模型。

来源：2024年第10期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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