畜牧兽医学报

作者：黄显朋, 邢嘉仪, 白媛媛, 姜雨婷, 麻志伟, 付伟, 兰道亮

单位：1. 西南民族大学畜牧兽医学院, 成都 610041;2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室, 成都 610041

关键词：牦牛,基因克隆,序列分析,慢病毒载体

基金：国家重点研发计划(2021YFD1600200);国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-37);西南民族大学中央高校基本科研业务费专项(2022NYXXS020)

旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL)，构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3~5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料，利用RT-PCR技术克隆牦牛6个多能性相关转录因子OSKMNL的完整编码区序列，并对其进行生物信息学分析；应用无缝克隆技术构建慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry；用293T细胞包装慢病毒，将包装好的慢病毒感染293T细胞和牦牛成纤维细胞，通过观察荧光表达和RT-PCR技术检测病毒感染情况(试验分为病毒感染组和空白对照组，每个组设置3个重复)。结果表明，克隆的牦牛OSKMNL基因的编码区大小分别为1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp；序列分析发现牦牛OSKMNL氨基酸序列与黄牛的同源性在99%以上，其中Sox2、Klf4、c-Myc与黄牛的同源性为100%；进化树结果显示牦牛与黄牛、瘤牛、水牛的亲缘关系最近，与小鼠的亲缘关系最远；蛋白结构预测发现牦牛的6个转录因子OSKMNL都具有该基因家族相应蛋白功能的结构，比如POU结构域、HOX结构域、HMG结构域、Znf-C2H2结构域、HLH结构域、CSP结构域等；构建了慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry；慢病毒感染293T细胞发现试验组表达红色和绿色荧光；慢病毒感染牦牛成纤维细胞发现试验组表达红色和绿色荧光，RT-PCR结果显示预期大小的条带。本研究成功克隆了牦牛的6个多能性相关转录因子OSKMNL；构建了分别携带牦牛3个转录因子的慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry；包装的慢病毒能感染牦牛成纤维细胞。有利于推动多能性相关转录因子OSKMNL在牦牛干细胞中的应用，也为后续研究牦牛iPSC做准备。

来源：2024年第4期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

查看畜牧兽医学报杂志2024年第4期