畜牧兽医学报

作者：董欣怡, 李锦群, 陈钦玺, 廖明, 曹伟胜

单位：华南农业大学兽医学院, 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室, 农业部兽用疫苗创制重点实验室, 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室, 广州 510642

关键词：J亚群禽白血病病毒,实时荧光定量PCR,混样检测,筛查技术

基金：广东省重点领域研发计划项目（2020B020222001）；广东省家禽产业技术体系（2023KJ128）；国家肉鸡产业技术体系（CARS-41-G10）

为缩短J亚群禽白血病病毒（subgroup J avian leukosis virus，ALV-J）检测周期，进一步加快禽白血病净化进程，本研究结合SYBR Green Ⅰ qPCR和混样检测，建立了一种适用于低ALV-J流行率场景下的快速筛检ALV-J的血液核酸筛查技术（ALV-J blood quantitative polymerase chain reaction，ALV-J-B-qPCR）。根据GenBank中ALV-J pol及env基因序列，设计ALV-J的特异性引物，并优化反应条件，建立了ALV-J SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法。以ALV-J病毒分离为阳性的鸡抗凝血为实验材料，分别制备抗凝血DNA、血细胞DNA、外周血淋巴细胞DNA、外周血淋巴细胞cDNA和血浆cDNA 5类血液检测模板进行ALV-J的PCR检测，筛选最佳检测模板；进一步比较蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法，血液混样总体积为200 μL的混样方法，血液混样总体积为10 μL的混样方法共3种混样方法的检测准确性，筛选最佳混样方法。综合上述qPCR方法、检测模板与混样方法，成功建立了ALV-J-B-qPCR。运用ALV-J-B-qPCR分别进行预期流行率为1%~2%、4%~5%场景下的模拟筛查试验，并与病毒分离法比较。qPCR方法的特异性、灵敏性和重复性试验显示，该方法仅特异性扩增ALV-J，对标准质粒的最低检测限度为1×102 copies·μL-1，批内与批间变异系数均<1％。对90份临床送检血液样品的检测结果显示，该qPCR方法对ALV-J的检出率（15.6%）高于p27抗原ELISA和普通PCR的检出率（12.2%）。检测模板筛选试验中，抗凝血DNA最符合检测准确度高、操作复杂度和成本低的要求，为最佳检测模板。混样方法摸索试验中，混样总体积为10 μL（混样规模<12份）的混样方法检测准确性最高，为最佳混样方法。在样本数为400份，预期流行率为4%~5%场景的模拟筛查中，ALV-J-B-qPCR检出率为6.25%，比病毒分离法高2.00%；在样本数为400份，预期流行率为1%~2%场景的模拟筛查中，ALV-J-B-qPCR检出率为2.25%，比病毒分离法高0.75%。本研究建立的ALV-J-B-qPCR技术具有灵敏性高、检测快速和节约成本的优势，为种禽场加快ALV净化进程提供了新的思路和方法。

来源：2024年第3期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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