畜牧兽医学报

作者：荆扬, 王玉淼, 李洋, 常辉, 马志倩, 李志伟, 肖书奇

单位：1. 中国农业科学院兰州兽医研究所 兰州大学动物医学与生物安全学院 动物疫病防控全国重点实验室, 兰州 730046;2. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100;3. 塔里木大学动物科学与技术学院, 阿拉尔 843300

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒,过表达细胞系,ORF6基因,M蛋白,MARC-145细胞

基金：国家自然科学基金面上项目（32172846）；甘肃省自然科学基金项目（23JRRA1153）

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料，本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSV ORF6基因的重组慢病毒质粒，将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒；之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞，利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选，连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145ORF6细胞系；并使用CCK-8试验评估过表达PRRSV M蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹（Western blot）和间接免疫荧光（IFA）评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位，进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响；此外，还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明，过表达PRRSV M蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响；RT-qPCR、Western blot和IFA等试验结果表明，MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外，稳定表达PRRSV M蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因；多步生长曲线表明，MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖，提高其病毒滴度。综上，本研究构建了可以稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145ORF6细胞系，发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

来源：2024年第3期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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