畜牧兽医学报

作者：陈孟娟, 刘雨晴, 王智通, 温佳乐, 许会芬, 于光晴, 李明

单位：河南农业大学动物科技学院, 郑州 450046

关键词：新西兰白兔,BMP15基因,克隆,组织表达,细胞定位

基金：国家自然基金青年项目(32102833);中国博士后科学基金第70批面上项目(2021M701107);河南农业大学大学生创新创业项目(2022DC051)

旨在获得新西兰白兔 BMP15基因序列及其组织表达规律,构建其真核表达载体,预测BMP15的生物学功能。本研究选择180日龄性成熟的健康新西兰白兔作为研究对象,采用 RT-PCR 技术扩增BMP15 基因CDS区序列,利用T4连接方法将目的片段连接至线性化的Pmcherry-N1和pCMV-Myc空载体,构建真核表达载体,利用生物信息学分析其编码蛋白的性质及结构。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 技术与Western blotting技术检测pCMV-Myc-BMP15过表达情况。接下来,使用qRT-PCR检测BMP15 基因在不同组织中的表达水平。激光共聚焦方法检测BMP15基因的亚细胞定位。利用免疫荧光技术检测内源BMP15在新西兰白兔卵巢组织定位情况。结果表明:克隆得到新西兰白兔BMP15基因CDS区序列长1 182 bp , PCR及测序结果表明pCMV-Myc-BMP15和 Pmcherry-N1-BMP15真核表达载体构建成功。生物信息学分析显示,BMP15基因编码393个氨基酸;BMP15蛋白不稳定系数为55.32,等电点大小为9.69 ,是一种稳定的碱性蛋白质。BMP15蛋白共有26个磷酸化位点,15个糖基化位点,存在信号肽,不存在跨膜结构域。系统进化树表明,新西兰白兔与猪亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。二级结构和三级结构分析结果表明,BMP15蛋白主要由α-螺旋(38.68%)、无规则卷曲(37.4%)、延伸链(15.52%)、β-转角(8.40%)组成, 为混合型蛋白。蛋白互作关系预测发现,BMP15蛋白与FSHR、FIGLA、BMPR1B、AMHR2、NOBOX等卵巢生长发育的相关蛋白之间存在相互作用。不同组织表达分析显示,BMP15 基因在卵巢组织中特异性表达;激光共聚焦结果显示,BMP15 主要存在于在细胞质中。将pCMV-Myc-BMP15转染至HEK293T细胞内,BMP15的mRNA水平和蛋白水平均显著上调。卵巢组织免疫荧光检测结果显示,BMP15主要定位在卵巢颗粒细胞的细胞质中。本研究成功构建了BMP15的真核表达载体,对BMP15基因及其编码的蛋白的理化性质和生物学特性进行了预测分析,在HEK293T细胞内成功过表达,并得到了该基因的亚细胞定位情况、组织表达情况及在卵巢组织的分布情况。为后续开展BMP15基因在卵巢生长发育中的功能及机制研究提供了理论依据。

来源：2024年第2期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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