畜牧兽医学报

作者：张晨俭, 李隐侠, 丁强, 刘伟佳, 王慧利, 何南, 吴家顺, 曹少先

单位：1. 南京农业大学动物科技学院, 南京 210095;2. 江苏省农业科学院畜牧研究所, 江苏省畜禽精准育种工程研究中心, 农业农村部种养结合重点实验室, 南京 210014;3. 山东农业大学动物科技学院, 泰安 271017

关键词：山羊胚胎,细胞因子信号传导抑制因子2,CRISPR/Cas9,基因编辑

基金：江苏省种业振兴揭榜挂帅项目（JBGS〔2021〕025）；江苏省重点研发计划项目（BE2019373）

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA，为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA，构建表达载体，体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA；体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率；在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组，2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物，对照组注射超纯水，以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板，PCR扩增靶区域并测序鉴定，发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式；根据在线网站预测，每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测。结果表明，在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体，体外转录获得高质量sgRNA和Cas9 mRNA；两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA；SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%，160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换，概率为95.0%，其中81.3%发生了移码突变，9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子，累计90.6%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除；SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%，80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换，概率为87.5%，移码突变概率为75.0%，5.0%的克隆缺失了96号氨基酸密码子，累计80.0%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除。另外，在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶。综上，SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除，为高效制备SOCS2基因敲除山羊，培育快长型肉用山羊奠定了技术基础。

来源：2024年第1期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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