畜牧兽医学报

作者：宋雯妍, 张瀚文, 吴澳迪, 张丽燕, 刘照, 叶桐桐, 陈创夫, 盛金良

单位：石河子大学动物科学院, 石河子 832000

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒,GP5蛋白,纳米抗体,噬菌体展示技术,病毒复制

基金：国家自然科学基金（31960691）；自治区研究生科研创新项目（XJ2022G119）

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）GP5蛋白的特异性纳米抗体，并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化，使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼，并于第0、14、28、42 天时采血，检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞，提取细胞总RNA，反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区（VHH）片段，并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞，利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后，淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体，通过间接ELISA方法鉴定其反应原性，后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1（-）中，利用Lipofectamine3000转染至Marc-145细胞内，与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h，以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明，成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化，得到浓度为2.16 mg·mL-1的重组蛋白，对羊驼三次免疫14 d后，其体内抗体效价高达1∶819 200，构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库，库容量达2.93×107 CFU·mL-1，插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后，最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示，2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc-145细胞内，它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录，展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体，且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力，研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。

来源：2024年第1期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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