畜牧兽医学报

作者：肖金龙, 王浩, 万全, 沈珏, 张博, 赵维薇, 邓静, 王喜, 赵汝, 肖鹏, 高洪

单位：1. 云南农业大学动物医学院, 昆明 650201;2. 云南农业大学食品科学技术学院, 昆明 650201;3. 云南农业大学动物科学技术学院, 昆明 650201

关键词：大肠杆菌,高致病性毒力岛,焦亡,猪小肠上皮细胞,NLRP3/ASC/Caspase-1通路

基金：国家自然科学基金资助项目(31660704;31960692);2021年度云南省研究生优质课程建设项目(2021YJSYZKC05)

旨在研究撒坝猪源E. coli高致病性毒力岛(highly pathogenic virulence island, HPI)诱导IPEC-J2细胞焦亡的机制,本研究以LPS+ATP为阳性对照,将实验室前期筛选的E.coli HPI及通过CRISPR/Cas9基因敲除技术构建完成的E. coliΔHPI感染IPEC-J2细胞,观察细胞损伤情况;RT-qPCR测定各组作用0.5、3、6、9、12 h后细胞内焦亡通路中关键因子NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3 (NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、胱天蛋白酶-1 (caspase-1)、消皮素D (gasderminD, GSDMD)及炎性因子白介素-18 (IL-18)、白介素-1β (IL-1β)的mRNA转录水平;激光共聚焦观察NLRP3/Caspase-1炎性复合体组装及表达情况;Western blot测定GSDMD及其活化形式GSDMD-N蛋白表达水平,PI染色检测胞膜完整性。结果表明:LPS+ATP处理显著促进细胞焦亡的发生,阴性对照组细胞正常生长、轮廓清晰,E. coli感染组及LPS+ATP组细胞出现变形、脱落、边界模糊等明显细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),且HE染色显示,E.coliHPI感染相较于E. coli ΔHPI感染对细胞的损伤更严重;E. coli HPI组中的焦亡通路关键因子及炎性因子mRNA水平在3~9 h均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于E. coli ΔHPI组;NLRP3/Caspase-1炎性复合体在细胞质中发生组装,且E. coli HPI组NLRP3/Caspase-1蛋白荧光强度、GSDMD、GSDMD-N蛋白表达水平及PI染色阳性率均极显著(P<0.01)高于E. coli ΔHPI组;E. coli HPI组的CPE、HE染色、焦亡通路关键因子及炎性因子mRNA水平、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达量、NLRP3/Caspase-1共定位情况均与LPS+ATP组相似。结果提示,撒坝猪源E.coliHPI通过上调NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路中关键因子mRNA水平,诱导NLRP3/Caspase-1炎性复合体的组装,促进焦亡标志蛋白GSDMD及GSDMD-N的表达,并对IPEC-J2细胞膜进行打孔,从而诱导细胞发生焦亡。

来源：2023年第12期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

查看畜牧兽医学报杂志2023年第12期