畜牧兽医学报

作者：杨芷翊, 王新凯, 史玉婷, 付思源, 张钰炘, 曹琛福, 贾伟新

单位：1. 华南农业大学兽医学院 国家禽流感专业实验室(广州)/广东省人兽共患病防控制剂工程实验室/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业农村部人畜共患病重点实验室/广东省动物源性人兽共患病防控重点实验室, 广州 510642;2. 深圳海关动植物检验检疫技术中心, 深圳 518045

关键词：H5亚型禽流感病毒,CRISPR,等温扩增,核酸检测

基金：广东省科技计划项目(2021B1212030015);国家现代农业产业技术体系(CARS-41)

采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统,建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5 亚型核酸检测新方法。通过分析 342 条禽流感病毒H5 亚型的 HA 基因序列,选取保守性区域设计具有强特异性的 CRISPR RNA(crRNA) 序列以及 RT-RAA 引物,并对检测体系中的主要成分 LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix 含量进行优化,建立了基于 RT-RAA 的AIV H5 亚型核酸 CRISPR-Cas13a 检测方法。取 105~1 copies·μL-1含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明,本文设计的 RT-RAA 引物与 crRNA 特异且灵敏,其最佳反应体系中主要成分用量分别为 LwaCas13a蛋白(60 μg·mL-1)2.0 μL、crRNA(100 μmol·L-1)3.2 μL、TaqMan探针(50 μmol·L-1)1.28 μL、T7 RNA Polymerase 0.25 μL、NTP Buffer Mix 2.0 μL。该方法检测灵敏度可达 1 copy·μL-1,且与 AIV H3、H6、H7、H9、H10 亚型以及 NDV、IBV、IBDV、DTMUV 无交叉反应。对 56 份已知的临床样品进行检测,检测结果与荧光定量 RT-PCR 符合率为98.2%。综上,本研究通过 RT-RAA 等温扩增技术结合 CRISPR-Cas13a 基因编辑技术建立了针对 AIV H5 亚型的快速检测平台,该方法从样本的核酸抽提到获得检测结果的时间控制在 1 h 20 min 以内,为 AIV H5 亚型高灵敏度和高特异性的临床快速检测提供了新的技术手段,具有良好的应用前景。

来源：2023年第9期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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