畜牧兽医学报

作者：胥辉豪, 冯雪倩, 朴雪玲, 慎晓军, 郑小波, 杨恒, 林珈好, 金艺鹏, 林德贵

单位：1. 西南大学动物医学院, 重庆 402460;2. 西南大学发光分析与分子传感教育部重点实验室, 重庆 400700;3. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193

关键词：猫,角膜缘干细胞,分离方法,培养体系

基金：国家自然科学基金（31972730）；西南大学实验技术研究项目（SYJ2020013）；深圳市瑞鹏公益基金会高校青年教师（小动物临床）科研基金（RPJJ2020001）

本研究旨在对比不同的分离与培养方法体外培养猫角膜缘干细胞（feline limbal stem cells，FLSCs）的效果，建立使FLSCs持续稳定增殖、结构及功能正常的最佳分离与培养体系。在手术显微镜下活体采集猫角膜缘组织，分别使用组织贴壁法（T法）、混合酶消化法（N法）、混合酶消化法联合组织贴壁法（NT法）分离FLSCs，鉴定LSCs标志蛋白ABCG2，以筛选最适分离方法。用BC培养基、DLM培养基和SCM培养基进行细胞培养，连续7 d细胞计数、观察细胞形态，选取LSCs的阳性标志物p63、波形蛋白和上皮分化标记物CK3、CK12定性分析第3、4、5代培养细胞。结果显示：3种方法分离的细胞中，ABCG2均呈阳性表达，NT法表达最强，表明3种方法均可分离FLSCs，NT法消化分离效果最好。3种培养基均可培养FLSCs，细胞形态无差异，细胞在DLM组中增殖速度最快，更快到达细胞生长峰值，与其他两组比，差异显著（P<0.05）。FLSCs生长曲线图呈典型"S"型，前72 h为迟缓期，72~216 h为对数生长期，216~264 h则基本处于平稳期，从264 h开始进入衰亡期。FLSCs群体倍增时间为38.9 h，平均最大增殖浓度为5.66×105 cells·mL-1。第3、4和5代FLSCs中波形蛋白、p63均呈强阳性表达，CK3和CK12不表达。使用NT法分离FLSCs，并在DLM中进行培养，可建立稳定增殖的FLSCs体外培养体系。

来源：2023年第7期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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