畜牧兽医学报

作者：王辉, 许梦缘, 刘灵康, 郑喜邦, 李恭贺, 吴文德

单位：广西大学动物科学技术学院, 南宁 530004

关键词：PhiC31整合酶,原核表达,电穿孔,RMCE,DF-1细胞,鸡

基金：国家自然科学基金(32060738;31660653);广西自然科学基金重点项目(2018GXNSFDA281026);广西科技计划重点研发项目(桂科AB16380098)

旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白,利用SUMO酶切除SUMO-His标签,获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应。之后,先将带有attPTT-DsRed2-attPCT片段的"着陆点"(landing pad, LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞,然后进行第二次电穿孔,将带有attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞,验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导,该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31 融合蛋白,经亲和层析纯化,SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L-1;该融合蛋白和切除SUMO-His标签的天然PhiC31蛋白均成功触发了pBCPB+质粒attP和attB位点之间的重组反应,重组效率基本一致(50% vs. 52%);以脂质体转染法将PhiC31真核表达质粒pCMVInt与LP质粒和donor质粒共转染DF-1细胞,荧光显微镜观察证实了DsRed2-EGFP 置换现象;以电穿孔方式将LP质粒、donor质粒和PhiC31蛋白先后导入DF-1细胞,获得了相同结果,表明PhiC31蛋白引发了attPTT与attBTT、attPCT与attBCT之间的重组反应。通过原核表达获得的PhiC31蛋白具有生物活性,有望成为一种重要试剂而用于Easi-CRISPR-TARGATT介导的转基因鸡研究。

来源：2023年第6期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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