畜牧兽医学报

作者：焦正兴, 潘阳阳, 王萌, 王靖雷, 马文斌, 高翔, 张晖, 崔燕, 余四九, 王立斌

单位：1. 甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070;2. 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心, 兰州 730070

关键词：牦牛,LC3B,原核表达,多克隆抗体,生殖

基金：国家自然科学基金(32160850);甘肃省自然科学基金(22JR5RA864);甘肃省重点人才项目(2022-0623-RCC-0307)

旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B, LC3B)基因,制备牦牛LC3B多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC3B基因序列,利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,Sepharose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(WB)、免疫组织化学法(IHC)和免疫荧光技术(IF)检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示,本研究成功克隆了牦牛LC3B基因(登录号:OP572227),构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 ku(含Trx和His标签),符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清,抗体效价分别为1∶640 000和1∶320 000,特异性良好,表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中LC3B的表达检测,LC3B在牦牛卵巢、输卵管和子宫中表达,并且能识别LC3B-Ⅰ和发生脂化后的LC3B-Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周。本研究通过成功克隆牦牛LC3B基因制备了牦牛LC3B多克隆抗体,使用抗体检测发现LC3B蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛LC3B蛋白的检测和细胞自噬水平的研究。

来源：2023年第6期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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