畜牧兽医学报

作者：费晓钰, 石超群, 刘雪明, 苏峰, 姜运良

单位：山东农业大学动物科技学院, 山东省动物生物工程和疾病控制重点实验室, 泰安 271018

关键词：猪,CRISPR/Cas9,Cre-LoxP系统,PCV2,MRC1

基金：山东省农业良种工程(2019LZGC019)；山东省重点研发项目(2019GNC106055)

旨在获得MRC1基因修饰的PCV2靶细胞并在体外验证该细胞对PCV2的抑制作用，为后续基因编辑猪的生产提供理论基础。本研究:1)首先利用基因工程技术建立了慢病毒介导的高效同源重组载体和CRISPR/Cas9基因靶向系统；2)通过细胞和分子生物学技术筛选了定点整合表达MRC1的PK15细胞系；3)随后通过细胞试验和PCV2的攻毒试验对其抗PCV2的作用进行了相关验证。结果：1)成功构建了含有红色荧光标记基因、嘌呤霉素标记基因、同向LoxP序列和多克隆位点的pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体，同时根据不同猪品种间MRC1基因启动子差异序列设计同源臂，成功构建同源重组载体和靶向同源臂的CRISPR/Cas9基因靶向载体；2)通过病毒包装和共转染的方法，利用嘌呤霉素筛选并验证了MRC1启动子基因编辑的PK15细胞株，成功将MRC1基因转录起始位点上游多出的14 bp敲入到PK15细胞中；3)随后对基因编辑的PK15细胞系进行抗病毒验证，MRC1基因编辑的PK15细胞株MRC1的蛋白表达量显著增高(P<0.05)，同时显著降低了PCV2的复制(P<0.05)。MRC1启动子编辑的PK15细胞中MRC1蛋白表达量显著增高，该位点可以用于抗PCV2猪的制备。

来源：2023年第3期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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