畜牧兽医学报

作者：陈俊贞, 权冉, 付强, 葛丽娟, 袁圆圆, 张成远, 李建林, 史慧君

单位：新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 830052

关键词：热休克蛋白,牛病毒性腹泻病毒,CRISPR/Cas9,复制

基金：国家自然科学基金（31902271；32060042）；自治区国际合作项目（2020E01006）；自治区百名博士引进计划

旨在探究热休克蛋白90 β家族成员1（heat shock protein 90 beta family member 1，HSP90B1）对牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）复制的影响。本研究通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western blot检测BVDV感染MDBK细胞后HSP90B1 mRNA和蛋白的表达情况，利用CRISPR/Cas9技术构建HSP90B1 KO细胞，计数检测敲除HSP90B1对细胞生长的影响，BVDV TC株感染HSP90B1 KO和对照组Scramble细胞后，使用qRT-PCR、免疫荧光、病毒滴度以及细胞病变效应（cytopathic effects，CPE）检测BVDV的复制情况。结果表明，qRT-PCR检测显示BVDV感染24 h时与空白组相比HSP90B1 mRNA转录水平显著升高（P<0.05），36 h后极显著升高（P<0.01），同时Western blot显示BVDV感染组HSP90B1蛋白的表达水平较未感染组明显增加；Western blot检测显示，与MDBK细胞相比HSP90B1 KO细胞中的HSP90B1蛋白表达量明显降低；细胞计数显示，相同生长时间的Scramble、HSP90B1 KO细胞与MDBK细胞的数量未见差异；qRT-PCR结果显示，与对照组相比，HSP90B1 KO细胞中BVDV 5'UTR RNA水平在BVDV感染12 h后显著降低（P<0.05），36 h后极显著降低（P<0.01）；免疫荧光检测结果显示，与对照组相比，HSP90B1 KO细胞中的绿色荧光明显减少；BVDV感染后病毒滴度与对照组相比，12 h后HSP90B1 KO的病毒滴度显著降低（P<0.05），36 h后极显著降低（P<0.01），CPE显示，在感染12 h后对照组细胞出现明显CPE，而HSP90B1 KO细胞仅显示出少量CPE，感染36 h后HSP90B1 KO细胞出现明显CPE，此时对照组细胞出现大量CPE并有细胞脱落。以上结果表明BVDV诱导MDBK细胞中HSP90B1的表达；利用CRISPR/Cas9技术成功敲除MDBK细胞的HSP90B1基因，构建HSP90B1 KO细胞，试验表明敲除HSP90B1能够抑制BVDV的复制。

来源：2023年第2期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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