畜牧兽医学报

作者：王逸群, 刘祖培, 李雅婷, 张海森, 李丹, 靳亚平, 陈华涛

单位：1. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100;2. 西北农林科技大学农业农村部动物生物技术重点实验室, 杨凌 712100

关键词：反刍动物,生物钟,核受体,繁殖,表达谱

基金：陕西省农业农村厅省级农业专项[NYKJ-2021-YL(XN)10]；国家自然科学基金面上项目(31771301)；国家自然科学基金青年科学基金项目(31602125)；西北农林科技大学2022年大学生创新创业训练计划项目(X202210712221)

旨在克隆奶牛核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)基因的蛋白编码序列(coding sequence，CDS)，构建其真核表达载体，预测分析NR1D1基因的生物学功能，并检测该基因的组织表达谱及其在卵巢组织的表达分布。本研究以5头健康的24月龄雌性奶牛为试验动物，PCR扩增带有同源臂的奶牛NR1D1基因CDS区全长片段，利用同源重组法将目的片段连接至线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA空载体，构建重组质粒，利用酶切、PCR及测序对重组质粒进行鉴定。结合质粒测序结果，利用生物信息学软件预测分析该基因的生物学功能。将鉴定正确的质粒转染至HEK293T细胞，利用实时荧光定量PCR(qPCR)与Western blotting技术检测NR1D1基因在mRNA与蛋白水平的表达。此外，利用qPCR检测奶牛NR1D1基因的组织表达谱，并利用免疫组织化学技术检测NR1D1蛋白在奶牛卵巢组织的表达分布。结果，成功获得带有同源臂的奶牛NR1D1基因的CDS区全长片段(1884bp)，酶切、PCR及测序结果表明pcDNA3.1-3HA-cNR1D1真核表达载体构建成功。生物信息学分析结果显示，NR1D1蛋白不存在跨膜结构，为核蛋白，其核定位序列存在于第200位氨基酸附近，且NR1D1蛋白中存在86个潜在的磷酸化位点；奶牛与小鼠NR1D1蛋白三级结构较为相似，奶牛NR1D1蛋白可能在奶牛生殖、代谢与免疫等生理过程中发挥重要作用。将pcDNA3.1-3HA-cNR1D1转染至HEK293T细胞，奶牛NR1D1基因在mRNA与蛋白水平均成功过表达。qPCR结果显示，NR1D1基因在奶牛瘤胃、结肠与肝中表达量显著高于其他组织；免疫组织化学结果显示，奶牛NR1D1表达于不同发育时期卵泡的颗粒细胞中。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因真核表达载体，且在HEK293T细胞成功实现了该基因的过表达，对奶牛NR1D1基因及其编码蛋白的理化性质与生物学特性进行了预测分析，并获得了该基因的组织表达谱及在奶牛卵巢组织的表达分布情况，为深入探究奶牛NR1D1基因的生物学功能提供了前期基础与关键材料。

来源：2023年第1期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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