畜牧兽医学报

作者：李琛, 何文峰, 赵丽娜, 凡启, 杨国庆, 刘慧敏

单位：河南农业大学生命科学学院, 郑州 450002

关键词：CRISPR/Cas9,ISG15,猪伪狂犬病病毒,基因敲除

基金：国家自然科学基金（31902268）；2021年度河南省高等学校青年骨干教师培养计划（2021GGJS034）

本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15，ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系，利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响，采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15-/-细胞感染PRV的增殖差异，通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平，Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平，以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明，sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因；CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明，敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响；间接免疫荧光检测结果表明，PRV感染后，PK15-ISG15-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞；RT-qPCR和Western blot结果表明，敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达；病毒噬斑试验进一步显示，敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外，RT-qPCR结果显示，敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15-/-细胞系，并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖，并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。

来源：2022年第10期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

查看畜牧兽医学报杂志2022年第10期