畜牧兽医学报

作者：李会, 熊静, 梅翠, 王士源, 周洋, 李晓芬, 付贵花, 张阳, 程鹏, 何玉张, 陈红伟

单位：1. 西南大学动物医学院, 重庆 402460;2. 西南大学医学研究院免疫学研究中心, 重庆 402460;3. 国家生猪技术创新中心, 重庆 402460

关键词：生物被膜,鼠源抗菌肽CRAMP,细胞毒性,稳定性,激光扫描共聚焦显微镜

基金：重庆市研究生科研创新项目(CYS21134)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(XDJK2019B040)；重庆市基础研究与前沿探索项目(cstc2018jcyjAX0466);2021年重庆市教育教学改革项目(213059)

旨在考察鼠源抗菌肽CRAMP的安全性、稳定性及其在清除铜绿假单胞菌生物被膜中的作用。采用兔血红细胞悬液的溶血性和小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)的细胞毒性考察CRAMP的安全性；采用不同温度、蛋白酶、金属离子和酸碱梯度对CRAMP抗菌活性的影响，考察其稳定性；通过在6孔细胞培养板中构建铜绿假单胞菌(PAO1株)成熟生物被膜，以人源抗菌肽LL-37和3种抗菌药为对照，采用结晶紫染色法检测生物被膜量，平板菌落计数法对生物被膜活菌数进行计数，苯酚-硫酸法结合Folin-酚试剂法检测生物被膜胞外基质含量，激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察CRAMP干预PAO1生物被膜形态学的变化。结果显示，CRAMP在所测试浓度下对兔血红细胞溶血率均<2%；在62.5~125 mg·L-1时对 RAW264.7没有细胞毒性。温度(25~100 ℃)、两种盐离子(Na+、K+)以及pH为5~10时对CRAMP的抗菌活性没有影响；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均不同程度影响了CRAMP的抗菌活性。6孔细胞培养板中，4倍MIC 的CRAMP极显著降低了PAO1生物被膜量(减少率为76.74%，P<0.01)，极显著减少了生物被膜中的活菌数量(减少了1.2个CFU·mL-1，P<0.01)，效果优于LL-37和3种抗菌药。CRAMP组的胞外基质显著低于空白对照组和LL-37组(P<0.05)。CLSM结果显示：与对照组相比较，4MIC浓度下，CRAMP组的细菌总荧光强度(PI+SYTO)显著低于空白对照组和LL-37组(P<0.05)；与空白对照组相比，CRAMP组和LL-37组的死菌荧光强度/活菌荧光强度比值 (PI/SYTO)均极显著增大(P<0.01)。综上表明，CRAMP具有低溶血性、低细胞毒性，除蛋白酶作用不稳定外，具有较好的稳定性，对PAO1成熟生物被膜具有明显的清除作用，且效果优于LL-37，具有良好的药物开发前景。

来源：2022年第5期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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