畜牧兽医学报

作者：赵为民, 王慧利, 曹少先, 郭日红, 王泽平, 陈哲, 徐奎, 付言峰, 李碧侠, 任守文, 程金花

单位：1. 江苏省农业科学院畜牧研究所 江苏省农业种质资源保护与利用平台, 南京 210014;2. 农业农村部种养结合重点实验室, 南京 210014;3. 江苏省农业科学院宿迁农科所, 宿迁 223800;4. 中国农业科学院深圳农业基因组研究所, 深圳 518124

关键词：CRISPR/Cas9,单碱基编辑,CD163基因,猪

基金：财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助；江苏省苏北科技专项(XZ-SZ201921)；扬州市重点研发项目(YZ2021037)；江苏省现代农业后补助项目(BE2020358)；江苏省自主创新资金项目(CX (19)2016)

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C>T的单碱基突变，形成终止密码子TAA，从而导致CD163基因翻译的提前终止。利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点，并且C5后续的两个碱基为AA，CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍。PCR扩增CD163-sgRNA和YE1-BE3-FNLS载体中的APOBEC-Cas9n-UGI片段，通过体外转录形成CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA。体外培养猪卵母细胞并进行孤雌激活，利用显微操作仪对孤雌胚胎进行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA注射，待胚胎发育至桑椹胚和囊胚阶段，提取胚胎基因组DNA对单碱基编辑区域进行PCR扩增测序。结果显示，在49个候选sgRNA中成功筛选出一个CD163-sgRNA，利用PCR成功扩增了CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段，注射CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA后的猪孤雌胚胎发育到2~4细胞期。挑选注射的20个2~4细胞期胚胎经过PCR扩增与产物测序后发现有12个胚胎的CD163基因的第7外显子的预期位点C (num1479)>T，单碱基编辑效率约60%。对CD163-sgRNA的off-target分析发现，在错配3个碱基的情况下该CD163-sgRNA有5个off-target区域，对这5个区域进行PCR扩增和sanger测序分析后发现都没有发生C>T的突变。本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上对猪的CD163基因进行了单碱基编辑，成功使得该基因第7外显子预期位点(num1479) C变为T，从而使得密码子CAA变为TAA，可提前终止CD163基因的翻译。

来源：2022年第4期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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