畜牧兽医学报

作者：曹艳桃, 樊江峰, 余四九, 周应聪, 杜培岩, 李一娟, 马进彪, 赵生贤

单位：甘肃农业大学动物医学院 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心, 兰州 730070

关键词：牦牛,早孕因子(EPF),原核表达,多克隆抗体

基金：“十三五”国家重点研发计划子课题（2018YFD0502303）；甘肃省科技重点研发计划（农业类）项目（20YF8NA131）；陇原青年创新创业人才项目（2021LQGR47）；甘肃农业大学科技创新基金（青年导师基金）项目（GAU-QDFC-2018-10）；国家自然科学基金（31660732）；甘肃省高校基本科研业务费

本试验旨在制备牦牛早孕因子（early pregnancy factor，EPF）多克隆抗体，为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础。采用RT-PCR方法，从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA，反转录为模板后进行EPF基因扩增，并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上，构建pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒，经PCR和测序鉴定后将阳性重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中。用IPTG诱导表达并优化表达条件，使用His标签镍柱纯化重组EPF蛋白并免疫小鼠制备抗体。结果显示，经PCR扩增的牦牛EPF基因在300 bp左右，符合预期结果，并通过测序验证获得重组阳性质粒。pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒转化后经IPTG的诱导，表达分子质量大小为29 ku的蛋白（其中包括早孕因子目标蛋白和SUMO标签蛋白），且在37℃、IPTG浓度为300 nmol·L-1、诱导6 h时获得最高表达量。Western blot结果显示，蛋白在上清和包涵体中均有表达，免疫后的小鼠抗血清能够与纯化后的重组蛋白发生免疫反应。本试验通过原核表达系统成功表达了重组牦牛EPF蛋白，制备了免疫原性较好的鼠抗EPF多克隆抗体。

来源：2022年第2期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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