畜牧兽医学报

作者：李梦妮, 王航, 傅思瑶, 杨梓纯, 许炎辉, 樊毛迪, 高崧, 刘秀梵

单位：扬州大学兽医学院, 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/农业农村部禽用生物制剂创制重点实验室, 扬州 225009

关键词：ChTLR15,单克隆抗体,抗原表位,免疫组化,细胞定位

基金：国家自然科学基金（31972711；31672553；31602059）；国家重点研发计划（2017D0500705；2017YFD500203）；扬州大学大学生创新创业训练计划项目；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

旨在制备鸡Toll样受体15（ChTLR15）的特异性单克隆抗体（mAb），并初步应用。利用PCR技术扩增ChTLR15第162-386位氨基酸，克隆于载体pET-30a中进行诱导表达，获得高纯度的重组ChTLR15（162-386 aa）蛋白。然后采用皮下多点注射方式将ChTLR15免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，常规获得针对ChTLR15蛋白的单克隆抗体。运用原核表达系统对ChTLR15基因进行截短表达，对单克隆抗体针对的ChTLR15抗原表位进行鉴定。利用6C7株单克隆抗体以激光共聚焦显微技术对鸡HD11细胞进行定位，同时，利用免疫组化技术确定ChTLR15在鸡部分组织中的分布情况。结果表明：成功构建重组质粒pET-30a-ChTLR15（162-386 aa），经IPTG诱导表达后，获得以包涵体形式存在的约26 ku的重组蛋白ChTLR15（162-386 aa）。方阵试验表明，最适血清稀释度为1：6 400，最适抗原包被浓度为0.35 μg·mL-1。采用有限稀释法进行4轮筛选，最终获得4株针对ChTLR15蛋白的单克隆抗体，将其以2G4、6C7、6D10、7C4进行命名。2G4与6C7的亚类为IgG2a，6D10与7C4的亚类为IgG1。Western blot结果显示，4株单抗均能与ChTLR15发生特异性反应，而不与其他受检蛋白反应。运用原核表达系统对ChTLR15（162-386 aa）进行截短表达，对ChTLR15单克隆抗体的抗原表位进行鉴定。结果显示，单抗2G4与7C4识别的抗原表位为230QLGTVLEF237，6C7与6D10识别的抗原表位为245EMDLLS250。细胞定位结果显示，ChTLR15蛋白位于细胞表面。免疫组化结果显示，健康对照鸡肝、脾、肺、肾均有微弱阳性染色，禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）感染鸡肝、脾、肺、肾阳性染色有所增强。本研究通过淋巴细胞杂交瘤技术成功获得4株抗ChTLR15蛋白的单克隆抗体，通过截短免疫原蛋白法对其识别的线性表位进行鉴定，可用于进一步研究ChTLR15的结构与功能，为后续信号通路、免疫机理、疫苗研发等相关领域的研究提供了有力工具。

来源：2022年第2期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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