畜牧兽医学报

作者：张记宇, 韩郁茹, 时洪艳, 陈建飞, 张鑫, 刘建波, 张燎原, 冯书风, 冯廷帅, 季朝阳, 石达, 冯力

单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队, 哈尔滨 150069

关键词：猪急性腹泻综合征病毒,N基因,荧光定量PCR,检测

基金：黑龙江省自然科学基金研究团队项目（TD2020C002）；黑龙江省自然科学基金（C2018066）

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV）检测方法，本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品，以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示，所建立方法在3.31×101~3.31×107拷贝·μL-1模板量时，呈良好的线性关系，相关系数（R2）为0.997，斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV；而猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×101拷贝·μL-1，组内和组间变异系数均小于1%，表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况，结果显示，SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低，在12~36 h病毒含量迅速增长，36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加，当MOI为1时，IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为106.7、105.3拷贝·mL-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测，结果发现病毒在空肠回肠含量较高，表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明，本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV，为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。

来源：2021年第10期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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