畜牧兽医学报

作者：贾艳艳, 赵莹莹, 余祖华, 何雷, 廖成水, 李静, 郁川, 张春杰, 李银聚

单位：1. 河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室, 洛阳 471000;2. 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室, 洛阳 471000

关键词：RNA干扰,B16F10细胞,Beclin-1基因,慢病毒载体,细胞自噬

基金：国家自然基金项目（31702219）；河南科技大学省部级科技创新平台培育项目（2015SPT004）

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系，分析稳转细胞系的自噬水平和活力，为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体，转染至293T细胞，获得慢病毒颗粒，将病毒颗粒感染B16F10细胞，通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果，Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况，CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明，成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA，纯化的慢病毒滴度为1×108 TU·mL-1，建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制，mRNA的沉默效率约为75%（P<0.01），发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量，降低B16F10细胞活力。以上结果表明，干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性，促进B16F10细胞死亡，这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。

来源：2021年第9期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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