畜牧兽医学报

作者：石玉华, 傅心雨, 郑梦洁, 吕倩, 师福山

单位：浙江大学动物科学学院, 杭州 310058

关键词：非经典细胞焦亡,gasderminD,GSDMD,质粒构建,蛋白表达

基金：国家自然科学基金面上项目（32072817）；浙江省教育厅科研项目（Y202045613）；浙江省重点研发计划项目（2021C02049）

旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制，本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型，利用PCR方法扩增人源目的基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30，使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中，构建重组真核表达质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC，利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后，采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况；通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型，分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功。结果显示：pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建，各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达，质粒共转染后LDH分泌显著升高，Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMD-p30片段，荧光显微镜观察到明显的PI染色，表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功。非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建，为进一步研究其激活机制奠定了基础。

来源：2021年第8期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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