畜牧兽医学报

作者：张仙玉, 赵鑫, 李国玲, 邢萍萍, 李紫聪, 杨化强, 吴珍芳, 陈斌

单位：1. 湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 410128;2. 华南农业大学动物科学学院, 国家生猪种业工程技术研究中心, 广州 510642

关键词：SSCs,体外培养,细胞增殖,功能鉴定

基金：国家科技重大项目（2016zx08006002）；国家自然科学基金（31772555）

旨在通过探索ICR品系小鼠精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）的体外稳定培养，为别的品系小鼠和大动物的SSCs体外培养提供参考。本研究采集6～8日龄ICR乳鼠的睾丸，用两步酶消化法（胶原酶和胰蛋白酶）和差速贴壁法来纯化SSC细胞。用不同的饲养层（小鼠胎儿成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，mEF）作为饲养层和层黏连蛋白与多聚赖氨酸联合铺板），不同的培养基（StemPro-34培养基和DMEM培养基），添加不同的生长因子（GDNF、LIF、EGF、bFGF、IGF1）来观察体外SSCs的生长。将传代至第6代的SSCs用免疫染色法和分子检测法来评估细胞增殖。最后将稳定增殖的SSCs移植到受体睾丸中进行功能鉴定。结果显示，通过两步酶消化法和差速贴壁法获得纯度约79%以上的SSCs细胞；mEF作为饲养层，StemPro-34作为培养基，组合添加GDNF、LIF、EGF、bFGF、IGF1生长因子能促进SSCs的体外长期培养；SSCs克隆集落用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）染色、PLZF和UCHL1蛋白免疫荧光检测均显示为阳性，用反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和荧光实时定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测显示，克隆集落高表达多能基因和自我更新基因，说明体外培养的SSCs实现了稳定增殖；SSCs （带有报告基因EGFP）移植到受体睾丸后，受体附睾中精子头部发出绿光，证明精子为供体SSCs来源。研究表明，本试验中的培养体系适用于ICR品系小鼠的体外培养，且稳定培养后的SSCs具有正常生物学功能。本研究为别的品系小鼠和大动物SSCs的体外培养提供了参考和借鉴。

来源：2021年第2期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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