畜牧兽医学报

作者：翟云云, 李佳佳, 张爽, 任子昱, 金前跃, 杜永坤, 万博

单位：1. 河南农业大学动物免疫学国际联合研究中心, 郑州 450002;2. 河南省动物免疫学重点实验室, 郑州 450002

关键词：伪狂犬病病毒,凋亡相关斑点样蛋白,先天性免疫,猪肾上皮细胞

基金：河南省重点研发与推广专项（科技攻关）（192102110191；202102110100）

本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系，通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率；CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异；RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平；Western blot检测PRV gE蛋白的表达；TCID50检测子代病毒感染力的滴定。结果表明：两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑，但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析，结果表明，sgRNA2的基因编辑效率最高；CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明，PK-15以及PK15-ASC-/-细胞活力无影响；流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞；定量RT-PCR结果表明，PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞，而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞；Western blot结果表明，PRV的gE蛋白在PK15-ASC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞；滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC-/-细胞系，并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。

来源：2021年第2期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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