畜牧兽医学报

作者：杨帅科, 邹佳辉, 蒋美君, 赵亚馨, 操继跃, 周红波

单位：1. 华中农业大学 动物医学院, 武汉 430070;2. 华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室, 武汉 430070

关键词：ALG5,CRISPR/Cas9,基因敲除,猪流感病毒

基金：国家自然科学基金项目（31761133005）

在实验室前期利用猪肾细胞（PK-15）CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（PK-15-GeCKO）筛选到猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶（ALG5）的前提下，深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA（gRNA）的质粒LentiGuide-puro-ALG5，并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮（NPTr）细胞系，采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株，通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平，通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID50和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时，检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示：获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系（ΔALG5），ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖，过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下，随着病毒的增殖，ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后，也可以抑制猪流感毒株F26的复制，无毒株特异性。本研究表明，ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子，为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。

来源：2020年第7期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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