畜牧兽医学报

作者：刘存, 邓永, 梁琳, 李金祥, 张彦明, 崔尚金

单位：1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;2. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100;3. 中国兽医药品监察所, 北京 100081;4. 农业部兽用药物与诊断技术北京科学观测实验站, 北京 100193

基金：农业科技创新工程项目（ASTIP-IAS15）

为了对牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）复制过程中正、负链RNA进行定量检测，通过生物学软件DNAStar和Primer express 3.0设计BVDV正、负链RNA特异性反转录引物并在其5'端添加非病毒核苷酸标签序列以区分BVDV正、负链RNA。同时设计荧光定量PCR引物与非病毒核苷酸标签序列组成引物对，建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR（ssRT-qPCR）方法，对其敏感性、重复性、特异性进行评估并利用所建立BVDV ssRT-qPCR对不同接毒剂量下BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA进行定量检测。结果表明，以构建的pMD18T-BV+和pMD18T-BV-质粒为标准品建立的BVDV正链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss（+）RT-qPCR]和负链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss（-）RT-qPCR]在102~107拷贝范围内具有良好的线性关系，线性相关系数分别为0.998 1和0.995 3；敏感性试验结果显示，ssRT-qPCR敏感性较好，ss（+）RT-qPCR最低检测下限为10拷贝，ss（-）RT-qPCR最低检测下限为100拷贝。重复性试验结果显示，所建立的ssRT-qPCR批内和批间的变异系数为均小于1%，方法重复性良好。特异性试验显示，所建立的ssRT-qPCR方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等不存在交叉反应，特异性较好。利用建立的ssRT-qPCR对不同感染剂量下细胞内BVDV正、负链RNA进行定量分析，结果显示以10、0.1 MOI剂量接种BVDV于MDBK细胞后，BVDV正、负链RNA变化呈现先升后降再逐渐上升的趋势。以1 MOI剂量感染MDBK细胞，BVDV正、负链RNA的动态变化趋势略有差异，整体呈上升趋势。10、1 MOI接毒剂量接种细胞后，BVDV正、负链RNA在感染后36 h基本维持稳定水平，以0.1 MOI接种细胞后BVDV正、负链RNA在感染后24 h即达到稳定水平。BVDV链特异性检测进一步验证了所建立方法的适用性。该研究建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR方法并利用该方法对BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA的动态变化过程进行描述，为研究宿主蛋白抗病毒机制、BVDV基因组RNA复制及调控机制等研究提供了研究手段。

来源：2019年第10期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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