畜牧兽医学报

作者：吴海波, 边雪娇, 贾丽玲, 索伦

单位：1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院, 上海 200011;2. 上海交通大学系统生物医学研究院, 上海 200240

基金：国家重点研发项目（2018YFC1003004）

旨在利用二代靶向测序技术比较不同靶区对CRISPR/Cas9基因编辑结局的影响，为该技术应用过程中的靶区筛选提供技术参考。本研究进行如下试验：1）以小鼠Pyk2基因为研究对象，针对其第一外显子区设计3个靶区，通过打靶质粒构建、细胞转染及转染细胞DNA二代靶向测序等手段发现，不同靶区总体的基因编辑（Indels）效率相差较大（site1：32.0%；site2：7.9%；site3：69.5%），编辑修复的偏好性也存在较大区别；而对于同一靶区，总编辑效率在2组试验重复中较为稳定（site1：31.8%vs 32.3%；site2：7.4%vs 8.4%；site3：71.3%vs 67.8%），编辑的偏好性也相对一致；2）针对上述筛出的最佳靶区site1，通过sgRNA与Cas9体外转录、小鼠胚胎显微注射和移植及子代的基因型鉴定等手段，结果发现，上述靶区的基因编辑偏好性在基因编辑动物生产中也得到证实；3）利用上述得到的site1靶区插入一个碱基的突变小鼠，在原靶区位置设计与site1仅相差一个碱基的sgRNA。通过突变小鼠基因组PCR和Cas9酶体外切割试验发现，靶区切割位点单碱基的插入就对该靶区编辑的效率产生显著影响（49.2%vs 0%）。综上所述，靶区选择对CRISPR/Cas9基因编辑的结局影响显著，通过二代靶向测序可以有效筛选CRISPR-Cas9基因编辑靶区，并在模式动物生产过程中也获得较好的结果。此外，针对靶区切割位点的单个碱基插入对基因编辑效率影响显著。

来源：2019年第8期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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