畜牧兽医学报

作者：郑兰兰, 朱静静, 王盼, 舒燕, 梁青青, 李炳晓, 王超群, 魏战勇

单位：1. 河南农业大学牧医工程学院, 郑州 450002;2. 河南省动物性食品安全重点实验室, 郑州 450002;3. 许昌海关, 许昌 461000

基金：国家重点研发计划（2018YFD0501205）；许昌市基础与前沿项目（JC2018005）

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列，设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体，构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针，进行反应条件和反应体系的优化，建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法，并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明，该方法能有效扩增1.0×101~1.0×109拷贝·μL-1的PDCoV标准质粒，建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×101拷贝·μL-1；对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应，具有很好的特异性；重复性试验结果显示变异系数（CV）小于1%，重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测，PDCoV的阳性检出率为23%（23/100），与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪，取攻毒后不同时间的粪便样品，应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测，TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明，本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV，可用于临床PDCoV的检测。

来源：2019年第6期

《畜牧兽医学报》期刊编辑部

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